20140328药典法新增—拉曼光谱法(三) 发布日期：2014-04-02 00:00:00 文章来源：银河集团:198net
由于拉曼信号绝对强度的波动，使用内标是最普通和有效的减少可变性的方法。内标方
法有几种变通选择。可以有目的地加入一种内标，该内标应具有与待测物互不干扰的独特谱
带以便检测。在溶液中，也可利用溶剂的独特谱带，因为溶剂随样品不同将相对保持不变。
另外，在制剂中，如果赋形剂量大大超过待测组分，则可以使用该赋形剂的峰。在假设激光
和样品定位的改变将会同等地影响全光谱的前提下，全光谱同样可以用作参比。
样品测定中需考虑的重要因素还有光谱的污染。拉曼是一种可以被许多外源影响掩蔽的
弱效应。普通的污染源包括样品支持物（容器或基质）和周围光线。通常，这些问题可以通
过细致的实验方法来识别和解决。
仪器装置
根据获得光谱的方式，拉曼光谱仪可分为FT拉曼光谱仪和色散型拉曼光谱仪，但所有
的现代拉曼光谱仪均包括激光光源、样品装置、滤光器、单色器（或干涉仪）和检测器等。
⑴ 激光光源
表1列出几种在药学应用中经常使用的激光。紫外激光有时也有特殊应用，但是由于种
种原因在常规分析中很少采用。
⑵ 样品装置
可有各种各样的样品放置方式，包括直接的光学界面，显微镜，光纤探针（不接触或光
学浸入）和样品室（包括特殊的样品盛器和自动样品转换器）。样品光路也可设计成能获得
偏振相关拉曼光谱，这种光谱通常包含附加信息。样品装置的选择应根据待测物的具体情况
（如样品的状态、体积等）以及测量的速度，激光的安全性和样品图谱的质量要求等决定。
⑶ 滤光装置
激光波长的散射光（瑞利光）要比拉曼信号强几个数量级，必须在进入检测器前滤除。
普遍采用的是陷波滤波器，它具有滤波效果好和体积小等优点。另外，为防止样品不被外辐
射源（如房间灯光、激光等离子体）照射，需要设置适宜的滤波器或者物理屏障。
⑷ 光波处理装置
光波信号可通过色散或者干涉（傅里叶变换）来处理。任何合格仪器都适用于定性鉴别。
然而，选择定量测定用仪器时，应注意色散和线性响应可能在整个波谱范围内并不均衡（例
如当使用阶梯光栅分光镜时）。
⑸ 检测器
硅质CCD是色散仪器中最常用的检测器。这种冷却的阵列检测器允许在低噪声下快速
全光谱扫描，常与通常使用的785纳米二极管激光器配合使用。傅里叶变换仪器通常采用单
通道锗或铟－镓－砷化合物(InGaAs)检测器以配合钕：钇－铝－石榴红(Nd:YAG)1064纳米
的激光器在近红区使用。
仪器校正
拉曼仪器的校准包括三个要素：初始波长（X轴）、激光波长以及强度（Y轴）。
仪器供应商应提供可由用户可以执行的对仪器相关参数校准的方法。除另有规定外，使
用者应根据仪器所提供的校准方法制定具体的SOP，并严格按照SOP对上述参数进行验证。
特别需要注意的是，激光波长变化可影响仪器的波长精度和光度（强度）精度。即使是
最稳定的激光器，在使用过程中其输出波长也会有轻微变化。所以，激光波长必须经校正以
确保拉曼位移的准确性。可以使用仪器供应商提供的拉曼位移标准参考物质进行定期校正。
某些仪器可以用一种拉曼内标物与初级光路分离，外在校准装置通过散射辐射准确地重现这
一光路。
推荐使用外部参考标准对仪器进行校正。
方法验证
必须对方法进行验证，至少应考察准确度、精密度等主要指标。但这些指标受诸多可变
因素的影响，其中荧光可能是影响方法适用性的主要因素。样品中荧光杂质的存在完全随样
品而异。所以，方法必须能适应不同的样品体系，必须足以将杂质的影响降到最小。
检测器的线性必须适应可能的信号水平范围。荧光可能使信号基线比验证时高，这时必须设法将荧光减弱或者使验证的方法适应较高的荧光水平。这一要求对方法的精密度，检测限（LOD）和定量限（LOQ）同样适用，因为基线噪声的增加会对这些数值产生影响。由于荧光使基线漂移可能同样会影响定量，所以使用时，同样需要在不同的光漂白作用水平进行可接受的定量验证。
必须确定激光是否对样品造成影响。在不同激光功率和暴露时间的条件下，对样品目视
检查和仔细审视测得的拉曼光谱可以确定样品是否改变（而不是光漂白作用）。观察的依据
是谱带位置、峰强和谱带宽度是否改变或者背景强度是否有明显变化。
影响方法精密度的因素还包括样品的位置和固体、液体样品的形态，在校正模型中必须
严密控制或说明。样品的制备方法或样品试架的形状可能影响测量灵敏度，而且，该灵敏度
会随着仪器的激发光和采集光学设置的不同而不同。
测定法
测定拉曼光谱可以采用以下任一物质态：结晶态、无定型、液体、气体或等离子体。
液体能够在玻璃管或石英管中直接测量。无定型和微晶固体也可充填入玻璃管或石英管中直接测定。为了获得较大的拉曼散射光强度，通常使照射在样品上的入射光与所检测的拉曼散射光之间的夹角为0º，90º和180º。样品池的放置可有多种方式。
除另有规定外，一般用作鉴别的样品不必制样，用作晶型、异构体限度检查或含量测定
时，供试品的制备和具体测定方法可按正文中各品种项下有关规定操作。
某些特殊样品技术可被应用于表面增强拉曼光谱和显微拉曼光谱测量。
为防止样品分解，常采用的办法是旋转技术。利用特殊的装置使激光光束的焦点和样品
的表面做相对运动，从而避免了样品的局部过热现象。样品旋转技术除能防止样品分解外，
还能提高分析的灵敏度。
常采用内标法定量，在激光照射下，加入的内标也产生拉曼光谱，选择其一条拉曼谱带
作为标准，将样品的拉曼谱带强度与内标谱带的强度进行比较(通常比较谱带的面积或高
度)。由于内标和样品完全处于相同的实验条件下，一些影响因素可以相互抵消。
所选择的内标应满足以下要求：
①化学性质比较稳定，不与样品中被测成分或其它成分发生化学反应， ②内标拉曼谱
带和待测物的拉曼谱带互不干扰， ③内标应比较纯，不含有被测成分或其他干扰成分。对
于非水溶液，常用的内标为四氯化碳(11475px-1)；而对于水溶液，常用的内标是硝酸根离子
(26250px-1)和高氯酸根离子。对于固体样品，有时选择样品中某一拉曼谱带作为自身对照内
标谱带。
具有多晶现象的固体药品，由于晶型不同，可能导致所收集的供试品光谱图与对照品光谱图或标准光谱集所收载的光谱图不一致，遇此情况，应按该品种项下规定的方法进行预处
理后再绘制比对。
光谱的形状与所用的仪器型号和性能、激发波长、样品测定状态及吸水程度等因素相关。
因此，进行光谱比对时，应考虑各种因素可能造成的影响。
起草单位：江苏省食品药品检验所
审校：江苏省食品药品检验所 王玉
复审：中国药科大学 张尊建
